基因擴(kuò)增儀|濟(jì)南君意生物|pcr基因擴(kuò)增儀

熒光定量PCR中dna合成的注意事項

1、嚴(yán)格的提取RNA是最關(guān)鍵的一步，如果有條件就上Qiagen的盒子或者用Trizol等自己按照方法提取。

2、良好的總RNA，如果需要，可以純化，基因擴(kuò)增儀報價，獲取mRNA，純化的柱子好壞有差異，一般一分錢一分貨。

3、可參考一下 fermentas的revert Aid系列的反轉(zhuǎn)錄酶，選擇適合你的種類。

4、反轉(zhuǎn)錄后的效率測定，一定注意嚴(yán)格定量哦！引物的合成，普通基因擴(kuò)增儀，請采用色譜級別。稀釋時注意均勻。

PCR儀已經(jīng)成為分子生物學(xué)、臨床診斷、基因表達(dá)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種儀器。PCR儀在操作中常會遇到哪些問題呢？該如何解決呢？下面就跟隨君意生物的小編一起來了解一下吧：

1、PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤，這大多是由于聚合酶忠實性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，同時降低循環(huán)數(shù)。此外，四種dNTP的濃度不同也會出現(xiàn)該問題，此時應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物。

2、PCR跑膠，目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問題，則需要進(jìn)行細(xì)致的分析，因為引起該問題的可能很多?？上葯z查是否模板質(zhì)量問題，如有降解等，模板應(yīng)避免反復(fù)凍融。也有可能是抽提RNA時有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問題，可提高退火溫度，基因擴(kuò)增儀，少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時間太長，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時電壓太高、電泳液過久沒換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問題。如果不是由上述原因引起，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過大，制膠過程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對具體原因再采取相應(yīng)的措施?！　?/p>
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