液氮凍存管-杭州凍存管-蘇州陶邁森科學(xué)儀器

液氮法主要操作步驟為：(1)選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存天尤好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用025%胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分敞的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于高心管中離心(1000r/min， 10 分鐘)。

2)離心洗滌:向培養(yǎng)瓶內(nèi)加5~10m1預(yù)冷的MEM使細胞懸浮，再將其吸出置離心管中，以1000rpm 離心8~10分鐘后棄去上清液。

3)細胞懸液的制備:向離心管內(nèi)逐滴緩慢加入預(yù)冷的凍存保護液，使細胞濃度為150~400萬/ml，細胞凍存管，然后迅速分裝于安瓿瓶中，每瓶加量為1ml。 

4)致冷凍:將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內(nèi)，直立置不同條件下致冷凍保存:a. 4℃兩小時后移至-20℃作用2小時，再移入-40℃4小時后在-70℃下24小時投入液氮。b. -20℃4小時后移至-40℃，經(jīng)4小時移人-70℃冰箱24小時，投入液氮。c. -40℃4小時后移入-70℃24小時后投入液氮。d. -20℃4小時后移入-70℃經(jīng)24小時后投入液氮中。

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融。當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶，相反，低溫凍存管，結(jié)晶就大，液氮凍存管，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破且裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

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