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犀牛陂村白蟻防治
常德市四種主要白蟻的mtDNA RFLP指紋圖譜的初步構(gòu)建
                                          姜麗紅1 鄒湘武1 寧滌非1席在星 2 
           （1.常德市白蟻防治所，湖南 常德，415000；2湖南文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 常德，415000） 


摘要：線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）是一種核外遺傳物質(zhì)。利用限制性?xún)?nèi)切酶處理mtDNA得到的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)既具有相對(duì)的科屬穩(wěn)定性，又能夠反映科屬間的進(jìn)化關(guān)系，因而已成為動(dòng)物科屬鑒定和系統(tǒng)演化研究的一種有效遺傳標(biāo)記。本文以工蟻為材料，用6種限制性?xún)?nèi)切酶分析了常德市4種白蟻線(xiàn)粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，根據(jù)限制性片段差異計(jì)算了4種白蟻之間的遺傳距離，利用MEGA 4軟件構(gòu)建了四種白蟻的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),探討了4種白蟻間的親緣關(guān)系，初步構(gòu)建了其RFLP指紋圖譜。 
：白蟻；mtDNA；RFLP；指紋圖譜


Primary construction of the mtDNA RFLP fingerprints of four kinds of termites in Changde City.


 JIANG Li-hong1, ZOU Xiang-wu1,NING Di-fei1,XI zai-xing2




(1.Termite Cool Institue of ChangDe, ChangDe 415000,China;2.College of Life Sciences,


 Hunan University of Arts and Science, ChangDe 415000,China)




Abstract: The mitochondrial DNA (mtDNA) is an extranuclear genetic material. Restriction


 fragment length polymorphism (RFLP) produced by the treatment of mtDNA using restriction


 enzyme mtDNA reflects both the relative stability and the evolutionary relationship between


 families and the genera. Thus, RFLP has become a valid genetic marker in the identification 


of animal families and genera and the study of systematic evolution. Using worker ants as


 the study material, mitochondrial DNAs of four termite species，


Coptotermes formosanus Shiraki，Reticulitermes fliceps Oshima，


Odontotermes formosanus Shiraki and Macrotermes barneyi Light were analyzed with six


 restriction endonucleases of six base pair recognition．


According to the restriction fragment length polymorphism (RFLP)，


the  genetic distance among the four termite species were estimated．


And the dendrograms of the four termite species were also constructed with MEGA 


4 method． We investigated the phylogenetic relationships among the four kinds of 


termites and construction of the four termites mtDNA RLFP fingerprints preliminary.


 Keywords: termites; mtDNA; RFLP; fingerprint


 


引言 
　　　線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）是一種核外遺傳物質(zhì)，與核DNA相比，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無(wú)組織特異性及提取方便等特點(diǎn)。昆蟲(chóng)mtDNA 由37個(gè)基因組成，包括2個(gè)rRNA 基因，22個(gè)tRNA基因和13個(gè)蛋白編碼基因[1]。線(xiàn)粒體DNA顯示出來(lái)的差異不是基因重組，而是基因突變的結(jié)果，所以mtDNA分析已成為研究種群遺傳和系統(tǒng)演化的重要方法。利用限制性?xún)?nèi)切酶處理mtDNA得到的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)既具有相對(duì)的科屬穩(wěn)定性，又能夠反映科屬間的進(jìn)化關(guān)系，因而已成為動(dòng)物科屬鑒定和系統(tǒng)演化研究的一種有效遺傳標(biāo)記[2]。 
　　　白蟻（termite）是一類(lèi)古老的社會(huì)性昆蟲(chóng)，其形態(tài)特征比較保守。白蟻的外部形態(tài)相似，體壁柔軟，骨化程度低，可分類(lèi)的性狀較少；此外，白蟻的生殖隔離機(jī)制主要不是通過(guò)生殖器官的結(jié)構(gòu)來(lái)完成的，無(wú)論雌雄，其有翅繁殖成蟲(chóng)的生殖器均為幾塊簡(jiǎn)單的骨片，分類(lèi)鑒定時(shí)無(wú)法采用生殖器的特征[3]。因此，白蟻主要依靠兵蟻或有翅成蟲(chóng)進(jìn)行分類(lèi)，白蟻的成蟲(chóng)期較短，有些白蟻類(lèi)群的兵蟻很少，且不少白蟻由于地域差異其形態(tài)有一定的趨同現(xiàn)象，僅僅依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行白蟻分類(lèi)通常不很可靠。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白蟻分類(lèi)研究中，這一技術(shù)有助于白蟻的分類(lèi)鑒定，對(duì)深入研究物種的系統(tǒng)進(jìn)化有重要意義。由于 mtDNA 遵循母性遺傳,本文以工蟻為材料，通過(guò)6種限制性?xún)?nèi)切酶分析了危害常德市四種白蟻:臺(tái)灣乳白蟻(Coptotermes formosanus Shiraki)、黃胸散白蟻(Reticulitermes fliceps Oshima)、黑翅土白蟻(Odontotermes formosanus Shiraki) 和黃翅大白蟻(Macrotermes barneyi Light)[4]的線(xiàn)粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，依據(jù)其mtDNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，探討了4種白蟻間的親緣關(guān)系，初步構(gòu)建了其RFLP指紋圖譜。 
1 材料與方法 
1.1 主要試劑及儀器 
　　飽和酚、、EDTA、Tris、SDS、瓊脂糖，溴乙錠，引物由生工生物工程有限公司合成，PCR試劑盒，紫外分光光度計(jì)，PCR 儀，電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，玻璃勻漿器，離心機(jī),6種限制性?xún)?nèi)切酶 
1.2 樣品采集 
    白蟻標(biāo)本采集于常德市河洑森林公園、德山公園。采回后存放于-80℃冰箱備用。 
1.3mtDNA的提取與純化 
　　以新采集的四種白蟻的工蟻（10頭）為材料，利用SDS法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[5]有關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟提取mtDNA與純化。 
1.4 酶切 
　　根據(jù)Kambhampati S [6]文獻(xiàn)參考，選取6種限制性?xún)?nèi)切酶,均為識(shí)別6堿基序列，分別為Pst I、Hind Ⅲ、BamH I、EcoR I、Xho I和EcoR v，均購(gòu)于上海生工公司。采用單酶切，10×buffer3μl，mtDNA 9μl，酶量為15U／管，ddH2O補(bǔ)充至30μl,vortex，酶解時(shí)間37℃2h-6h。 
1.5 電泳 
　　 取9μl酶切體系，加1μl10×Log buffer，混勻后加樣于含0.5μg/ml溴乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠上樣孔。0.5×TBE 電泳緩沖液,以λDNA／Hind Ⅲ 為分子量標(biāo)記。電泳條件：3V／cm 恒壓電泳1小時(shí)。電泳結(jié)束后將膠置于凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。 
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 
　　根據(jù)電泳結(jié)果即可確定酶切片段分子量的大小。數(shù)據(jù)的處理和分析目前普通采用Nei et Li[7]介紹的方法, 根據(jù)群體間(或個(gè)體間)共有消化片段的比例來(lái)決定mtDNA 的遺傳相似性。計(jì)算遺傳距離的公式如下: 
F=2Nxy／(Nx+Ny)                      (1) 
P=1一{[(F2+8F)-2-F]／2)} 1/r            (2) 
其中Nx和Ny分別為物種X和Y 的限制性酶切片段數(shù)；Nxy為兩者共有的片段數(shù)；r為限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列的堿基數(shù)，本研究r=6。F 為兩群間限制性片段共享度, P為兩群間的遺傳距離。然后按照MEGA 4軟件構(gòu)建四種白蟻mtDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 
2 結(jié)果與分析 
標(biāo)簽：     東莞市犀牛陂村白蟻防治   東莞市犀牛陂村白蟻防治廠(chǎng)家