SNU-1040細胞永生化人結腸癌

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傳代培養(yǎng)及其操作步驟：原代細胞培養(yǎng)成功以后，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的利處在于提供了大量的實驗材料，便于實驗。
傳代細胞培養(yǎng)操作步驟：（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。（2）向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2-5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。（4）吸出消化液，向瓶內加入Hanks液少量，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。（6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。（7）細胞培養(yǎng)換液時間應根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2-3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。
傳代細胞培養(yǎng)注意事項：（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。
體內細胞培養(yǎng)及其操作步驟：瘤細胞懸液接種（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或對數(shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞。（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經80～100目篩網過濾成細胞懸液。（3）培養(yǎng)細胞應用PBS洗兩遍。（4）計數(shù)并調整細胞濃度至10(7)～10(8)/ml。（5）常規(guī)消后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml/部位，＞10(6)細胞)。初次接種成功率低，細胞數(shù)盡可能多一些。（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。
腹水瘤的建立與腹水瘤的接種：將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細胞，將這種腹水反復傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌，進行細胞計數(shù)。（2）消動物，左下腹穿刺接種1×10(6)腹水瘤細胞。（3）接種腹水瘤細胞后約7-12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3-5ml。（4）抽取的腹水經3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆谩?br /> 培養(yǎng)細胞的凍存及復蘇：細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
凍存細胞：（1）選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數(shù)，使細胞密度達5×10(7)/ml左右密度，離心，去上清。（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％亞砜(DMSO) 或，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃/min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮。
復蘇細胞：（1）從罐中取出凍存管。（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。（3）凍存管用70％酒精擦拭消后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。（4）低速離心(500～1000r/min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。（5）用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。凍存細胞數(shù)量要充分，密度應達到10(7)/ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×10(5)/ml數(shù)量。" "


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購買的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸渾細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細胞置于-80℃太久等。建議嚴格參照ATCC的標準操作規(guī)程進行細胞復蘇、凍存等工作。
欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速?欲回收動物細胞，其離心速率一般為300×g(約1OOOrpm),5-10分鐘，轉速過高或離心時間過長都將造成細胞死亡。合適的離心轉速是根據(jù)相對離心力決定。RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中r為離心機轉軸中心與離心套管底部內壁的距離；rpm為離心機每分鐘的轉數(shù)；RCF(relative ceifugal force)為相對離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示單位。
為什么培養(yǎng)的細胞要及時傳代？體外培養(yǎng)的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細胞的生長得以繼續(xù)。
培養(yǎng)細胞生長減慢的原因在哪些?其解決辦法有哪些？可能的原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨眈肢或生長因子等耗盡或缺乏或己被破壞；培養(yǎng)物中有少量或污染；試劑保存不當；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清等，找出其它可能的原因。
解決辦法：增加起始培養(yǎng)細胞濃度；讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補加谷氨酷肢或生長因子等；用無培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，去棄培養(yǎng)物，或用*；血清需保存在5℃到20℃; 培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存;含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內用完;分離培養(yǎng)物，檢測支原體。
冷凍管應如何解凍？取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1-2分鐘內大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細胞，用75%酒精消凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細胞轉移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管爆裂。" SNU-1040細胞永生化人結腸癌 "


傳代細胞培養(yǎng)：原代細胞或細胞株或細胞系需在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的原代細胞或細胞株或細胞系或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)，這個過程體外培養(yǎng)稱為傳代細胞培養(yǎng)。一般認為，細胞培養(yǎng)形成單層匯合，細胞密度與生存空間有密切的關系，將培養(yǎng)細胞分散，以1:2或l:3或1:4以上的比率轉移分散進行培養(yǎng)，即為傳代細胞培養(yǎng)。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。
常用細胞分裂指數(shù)表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數(shù)/100個細胞。一般細胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力時期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進行各種試驗。
傳代細胞的培養(yǎng)：（1）吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。（2）每瓶加入2mL,無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經消化液鋪滿所有細胞表面，待細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2~3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化。（4）加入完全培養(yǎng)基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細胞的機械損傷。（5）用計數(shù)板計數(shù)，計算細胞的濃度，并用培養(yǎng)基調整適當?shù)募毎麧舛群笤俜制颗囵B(yǎng)。
傳代細胞的建系和維持
1、細胞檔案：細胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴增時間（分裂指數(shù)），細胞的特殊遺傳標志（標記染色體）等，這些記錄對于保證細胞的正常生長，保持細胞的一致和經長期培養(yǎng)細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。
2、換液傳代：（1）細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導致細胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。（2）多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時均應作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。"
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