葉酸測定用培養(yǎng)基

葉酸測定用培養(yǎng)基（又名葉酸干酪培養(yǎng)基）采用鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）為測定用菌，用于葉酸的微生物法測定。該培養(yǎng)基是基于Flynn等人(1)的配方，并經(jīng)Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于維生素測定的培養(yǎng)基通常需要三種：維持培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基和測定用培養(yǎng)基。后者通常是化學限定的培養(yǎng)基，包含所有測定菌生長所需的養(yǎng)分，但不含有待測的分子。類似的，葉酸干酪培養(yǎng)基包含鼠李糖乳桿菌生長所需的所有成分，但不包含葉酸。因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會觀察到鼠李糖乳桿菌生長的遞增。

鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）的貯備菌制備是在AOAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號M366）試管穿刺接種培養(yǎng)，35-37°C孵育18-24小時后，試管儲存在冰箱里。每月轉接一次。測定菌液的制備是將貯備菌轉種到含10ml微量維生素檢測接種肉湯（貨號M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號M367）的試管中。35-37°C孵育24小時后，在無菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸于10ml的無菌葉酸干酪培養(yǎng)基中（貨號M543）。再像之樣沉淀，并清洗一次。最后，清洗后的菌株重懸于10ml葉酸干酪培養(yǎng)基中，并用該培養(yǎng)基進行1:100稀釋。1滴重懸液用于接種到每個測定管中。也可用0.85% NaCl代替培養(yǎng)基來清洗和稀釋。

由于條件，孵育溫度等因素會影響標準曲線讀數(shù)，并且每次不會完全一樣，因此每次都應制備標準曲線。10ml管內(nèi)的標準品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

葉酸標準品的制備：將20mg葉酸干粉溶于含有20ml的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調(diào)整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調(diào)pH為 7.0。該溶液含有200mg葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩沖液A（貨號M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標準溶液。每管取0,0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。

樣本葉酸濃度的測定步驟：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的制備好的血清提取物。加入5ml葉酸干酪培養(yǎng)基和足量的蒸餾水，使每個試管的總體積為10ml。15*121°C5分鐘。冷卻試管并向每個試管中加入一滴接種液。35-37℃孵育18-24小時后進行濁度讀數(shù)。讀數(shù)前將試管冷藏15-30分鐘以停止生長。620nm檢測吸光度。待測樣品中的葉酸含量應根據(jù)標準曲線來確定，不過要考慮樣品稀釋度。

應非常小心，避免培養(yǎng)基和玻璃器具被污染。應使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導致錯誤的結果。

應用　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

葉酸干酪培養(yǎng)基用于葉酸的微生物法測定。鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）為測定用菌。

培養(yǎng)基組分　　　　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

最終pH值 (25°C)   6.7±0.1

質(zhì)量控制　　　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

?外觀——米黃色至黃色均一自由流動粉末

?制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

?配比濃度——在25°C下9.4%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.7±0.1

?pH值——6.60-6.80

配置　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

稱取9.4g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養(yǎng)基完全溶解。測定時，分裝至每管為5ml培養(yǎng)基（包含標準品和待測樣品）。加蒸餾水，使總體積達到10ml。高壓消毒15*121°C 5分鐘。立即冷卻。

培養(yǎng)反應　　　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

采用鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）進行葉酸的微生物法測定。35-37°C孵育16-18小時。

生長狀況　　　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

可獲得良好的生長。隨著測定管葉酸標準品濃度升高（即 0, 0.1,0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1ng），鼠李糖乳桿菌生長逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。

參考文獻　　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　

1. Flynn,Williams, ODell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180.

2. Baker, Herbert,Frank, Pasher, Hunter, Wasserman and Sobotka, 1959,Clin. Chem., 5, 275.

3. Waters and Mollin,1961, J. Clin. Path., 14, 335.

產(chǎn)品引用文獻