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供應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)平皿 BD Falcon 351029 100×15mm

北京市細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)平皿廠家

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規(guī)格型號(hào)： 100×15mm
生產(chǎn)廠家： BD Falcon
銷售區(qū)域： 全國(guó)

【諾博萊德】In situ cell death detection kit-POD法

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目錄號(hào)                  品名                                                             規(guī)格           價(jià)格
11684817910      In situ cell death detection kit,POD               50T            5899
11684795910     In situ cell death detection kit, Fluorescein    50T            5035
TUN11684817     TUNEL Apoptosis Assay Kit                           20Tests      2480

一、原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物聯(lián)（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA斷裂，因而沒(méi)有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過(guò)雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。
二、器材與試劑
器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；
試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、、梯度（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

三、實(shí)驗(yàn)步驟
操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。
具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測(cè)）：
1. 用浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理
4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min；
5. PBS漂洗2次；
6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100μl DNase 1，反應(yīng)在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450~500nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在組織處加50~100μlDAB底物，反應(yīng)15~25℃×10min；

13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用蘇木素或綠復(fù)染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。
15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）
對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：
①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見(jiàn)備注4），干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組離心收集約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；
③將吸附細(xì)胞的載玻片在4%（見(jiàn)備注2）中固定25min；
④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見(jiàn)備注5）中處理5min；
⑥PBS浸洗二次，每次5min；
后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6—15

四、注意事項(xiàng)
1. 進(jìn)行PBS 清洗時(shí)，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。
3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。
4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。
6. 用綠（Methyl Green）染液（3-5%綠溶于0.1M 醋酸 PH4.0）染色后，請(qǐng)用蒸餾水清洗多余的綠。然后進(jìn)行洗凈（）、脫水（）透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用80~90%的洗凈時(shí)，綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。
7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次*酸鹽和鈷等致癌物，可通過(guò)吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。
8. 試劑保存；未打開(kāi)的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DN**斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

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