TonkBio無(wú)縫克隆試劑盒價(jià)格,使用說(shuō)明書(shū)同科生物

產(chǎn)品名稱(chēng)：TonkBio無(wú)縫克隆試劑盒

英文名稱(chēng)：TonkBio Fast-Fusion Cloning Kit   

產(chǎn)品規(guī)格：

產(chǎn)品組成：

1、Fast-Fusion Enzyme

2、10× Fast-Fusion Buffer

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

TonkBio無(wú)縫克隆試劑盒基于DNA序列同源性進(jìn)行片段重組，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。將載體在克隆位點(diǎn)進(jìn)行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列 (15 bp～21 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，最快僅需反應(yīng)5 min，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡?yáng)性率可達(dá)95%以上。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、操作簡(jiǎn)便：無(wú)需考慮酶切點(diǎn)限制；

2、快速重組：15min實(shí)現(xiàn)載體和片段的快速重組；

3、效率更高：重組效率為傳統(tǒng)酶切連接技術(shù)的5-10倍，無(wú)載體自連現(xiàn)象，陽(yáng)性克隆可達(dá)90%以上。

產(chǎn)品應(yīng)用：

1、PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)載體

2、基因轉(zhuǎn)移

3、在插入片段前后插入adaptor、linker和標(biāo)簽

4、高通量克隆

實(shí)驗(yàn)方案

B．制備線性化載體

環(huán)形載體需要經(jīng)過(guò)線性化處理，使載體待重組區(qū)域暴露出來(lái)，以供與插入片段進(jìn)行重組拼接。線性化的方法可以通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切或PCR方法實(shí)現(xiàn)。若采用酶切進(jìn)行線性化處理，推薦進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收，以盡量避免為切割載體在轉(zhuǎn)化后造成假陽(yáng)性結(jié)果。若PCR擴(kuò)增得到線性化載體，推薦使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，減少PCR體系中的模板用量以減少初始質(zhì)粒造成的假陽(yáng)性，并在PCR結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收或使用DpnI酶消化殘余質(zhì)粒模板。

C. 插入片段的PCR引物設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)同源重組，插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物5’和3’末端需要帶有和線性化克隆載體兩個(gè)末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列（15?21 bp）。下圖以pUC19作為克隆載體為例，設(shè)計(jì)引物：

D. 插入片段的PCR擴(kuò)增

插入片段可選用任何DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，產(chǎn)物末端的A尾在重組過(guò)程中將會(huì)被去除，不會(huì)因此產(chǎn)生單堿基插入突變。推薦使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，以減少在插入片段中引入突變。請(qǐng)?jiān)?/span>PCR完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)獲得單一條帶的DNA片段。可切膠回收以除去模板、引物、引物二聚體?？赏ㄟ^(guò)與已知的DNA分子量marker比較，確定得到的DNA量。

E．重組反應(yīng)體系的建立以及反應(yīng)條件

在冰水浴中，配制如下反應(yīng)體系，將緩沖、水、線性化載體、插入片段加入PCR管中，輕彈混勻，最后加入酶。

最適線性化克隆載體與插入片段摩爾比為1:2，可由下列公式粗略計(jì)算獲得：

? 線性化載體 = [0.01 × 線性化載體長(zhǎng)度 (bp)] ng

? 插入片段 = [0.01 × 插入片段長(zhǎng)度 (bp)] ng

例如將長(zhǎng)度500 bp的插入片段克隆到長(zhǎng)度2.7 kb的pUC19中，克隆載體的最適使用量為：0.01×2700=27 ng，插入片段的最適使用量為：0.02×500=10 ng。

注意：1. 當(dāng)插入片段大于克隆載體時(shí)，兩者計(jì)算用量公式應(yīng)互換。

2. 線性化載體用量應(yīng)在20?100 ng之間，插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物用量應(yīng)在10?100 ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算DNA用量超出這個(gè)范圍是，請(qǐng)直接選擇使用量即可。例如插入片段200 bp，最適用量計(jì)算值為4 ng，實(shí)際反應(yīng)體系中應(yīng)加入10 ng。

反應(yīng)體系配制完成后，輕彈混勻，并通過(guò)短暫離心使其沉到管底，立即放入已預(yù)熱的PCR儀或平衡至所需溫度的水浴中。按下表中方案選其一進(jìn)行。推薦在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，60°C，15 min。（若選擇在37°C水浴反應(yīng)，請(qǐng)?jiān)?/span>10 μl反應(yīng)中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻10 min，然后直接轉(zhuǎn)化。也可選擇?20°C儲(chǔ)存，待需要時(shí)，冰上解凍并轉(zhuǎn)化。

F．轉(zhuǎn)化

推薦使用轉(zhuǎn)化效率≥10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞，按照對(duì)應(yīng)的說(shuō)明書(shū)操作。若轉(zhuǎn)化效率低于10⁸ cfu/μg，可在凃布前將培養(yǎng)的菌液在6000 rpm離心5 min，沉菌用100 μl培養(yǎng)基重懸后，全部涂于對(duì)應(yīng)抗性的平板上。過(guò)夜培養(yǎng)后，形成數(shù)百個(gè)單克隆，可根據(jù)需要選擇PCR或酶切鑒定是否為陽(yáng)性。

G．常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案