重組胰蛋白酶酶聯(lián)*吸附測定試劑盒 重組胰蛋白酶試劑盒 檢測更快捷

重組羧肽酶B酶聯(lián)吸附測定試劑盒使用說明書 （96T） 使用前請仔細閱讀說明書。若有任何問題，請聯(lián)系我們。 ?????????????? 試劑盒用途 該試劑盒用于體外定量檢測大腸菌液體中重組羧肽酶B含量。本試劑盒僅供研究或工業(yè)生產(chǎn)使用。 ? 試劑盒基本參數(shù) 靈敏度 ＝1 ng/ml 檢測范圍：0.25?- 64?ng/ml 特異性：可檢測重組羧肽酶B，與其它重組大腸菌表達系統(tǒng)相關(guān)蛋白無明顯交叉反應(yīng)。 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均 < 10%。 工作時間：熟練實驗人員可在2.5小時內(nèi)完成一次測定。 有效期：6個月 ? 試劑盒組成及保存 未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒，請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。 中文名稱 規(guī)格 保存條件 抗體包被的ELISA酶標板（96孔可拆卸) （MicroELISA Plate(Dismountable) 8孔×12條 -20℃ 凍干標準品?(A1) （Reference Standard） 32ng/支×4支 2-8℃ 濃縮辣根物酶化抗體?(A2) （Conceated HRP-Detection Ab） 1支×0.1?mL -20℃ 濃縮標準品&樣品稀釋液&?HRP-抗體稀釋液（25 X）?(P1) （Conceated?Reference Standard & Sample &?Conceated?HRP-?Ab Diluent (25x)） 1瓶×5ml 2-8℃ 濃縮洗滌液（25 X）(P2) （Conceated Wash Buffer (25x)） 1瓶×40 mL 2-8℃ 顯色底物（TMB）(A3) （Substrate Reagent） 5支×0.125?mL -20℃?避光 底物稀釋液（TMB）(P3) （Substrate Reagent） 1瓶×15 mL 2-8℃?避光 反應(yīng)終止液?(P4) （Stop Solution） 1瓶×5ml 2-8℃ 封板覆膜（可重復(fù)使用） （Plate Sealer） 5張 ? 產(chǎn)品說明書（User Manual） 1份 ? 質(zhì)檢報告（Certificate of Analysis） 1份 ? ? 說明: 1、所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染。 2、酶標板-20℃可存放6個月，2-8℃存放勿超過一周。 ? 試驗所需自備物品 1.酶標儀（濾光片波長450 nm和650nm） 2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭，加樣槽 3.37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 4.潔凈無紙屑的吸水紙或干布 ? 待測樣品注意事項 1.樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或 -80℃（3個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。 2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再測。 3.若使用化學(xué)裂解液制備的樣本或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。 ? 檢測前準備工作 1.?請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫，觀察溶液是否有結(jié)晶，如果有結(jié)晶按提示進行操作。提前15分鐘打開酶標儀預(yù)熱。 2.稀釋液配制 將濃縮標準品&樣品稀釋液&HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋（1：25）。 3.洗滌液配制 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1：25）。 ?提示:從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液溫度應(yīng)為室溫）。請當(dāng)日使用。 4.標準品配制 將標準品于1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘后，加入標準品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為32ng/ml）, 然后進行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度: ?32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5、0?ng/ml。樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/ml。 提示：溶解和稀釋標準品過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。 ? 倍比稀釋方法 取7只EP管，每管中加入500 μL標準品&樣品稀釋液，從32?ng/ml的標準品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL標準品&樣品稀釋的EP管中混勻配成16?ng/ml的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。 標準品稀釋圖例（以500 μL為例） ? 提示：最后一管直接作為空白孔，不再加入標準品工作液。 ? 5.HRP標記抗體工作液配制 實驗前請先將抗體管1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。實驗前計算實驗所需用量（以100 μL /孔計算），實際配制時應(yīng)多配制100-200 μL。使用前15分鐘，用HRP-抗體稀釋液將濃縮辣根物酶化抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1:125），當(dāng)日使用。 6.?顯色底物（TMB）工作液配制 計算實驗所需顯色底物用量（以100 μL /孔計算），實際配制時應(yīng)多配制100-200 μL顯色底物工作液。使用前15分鐘，用底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液 =1：20），避光保存，當(dāng)日使用。 ? 洗板方法 1.?自動洗板機：每孔加入洗滌液350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標準進行調(diào)整）， 注入和吸出間隔60秒。 2.?手工洗板： 甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干，每孔加入洗滌液350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標準進行調(diào)整），浸泡2-3分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙上拍干。 ? 操作步驟 1.將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔（復(fù)孔），每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL，若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。 提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動酶標板混勻避免產(chǎn)生氣泡。加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。 2.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。每孔加入350-400?μL（根據(jù)加滿孔的標準進行調(diào)整）洗滌液，浸泡2-3分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。 3.每孔中加入HRP-抗體工作液100 μL，輕輕晃動酶標板混勻避免產(chǎn)生氣泡，將酶標板覆膜并置于37℃孵育30鐘。 ?? 4.洗滌：用洗滌液洗板4次，方法步驟同2。 提示：酶標板洗滌不完全可能會造成標準曲線梯度差，或背景值高。應(yīng)注意加入洗滌液的體積，以加滿酶標板的孔為標準進行調(diào)整，確保所有的孔浸泡在洗滌液中并浸泡2-3分鐘。 5.顯色：每孔加底物顯色工作液（TMB）100 μL，將酶標板覆膜并置于37℃條件下孵育10分鐘。 提示: 加顯色底物推薦使用排槍和加樣槽，但應(yīng)嚴格避免底物污染，確保所使用的加樣槽潔凈或一次性使用，加液時移液槍的槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實驗結(jié)果。可通過觀察加樣槽中底物是否變藍預(yù)判底物是否被污染。根據(jù)實際顯況酌情縮短或延長，顯色時間在5-30分鐘范圍內(nèi)。當(dāng)標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。 6.終止：每孔加終止液50?μL，終止反應(yīng)，室溫放置1分鐘，推薦使用排槍和加樣槽。 提示:?終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實驗結(jié)果。 7.讀數(shù)：用酶標儀在450 nm波長（參考波長650nm）測量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。 ?提示: 請?zhí)崆按蜷_酶標儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置檢測程序。 ? 結(jié)果判斷 1.計算每組復(fù)孔的平均OD值。每個標準品的平均OD值減去空白孔的OD值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標（X），OD值為縱坐標（Y），繪出標準曲線（作圖時亦可去掉空白組的值）。 2.推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（請使用Logistic五參數(shù)擬合曲線計算方法繪制標準曲線）等。 3.若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。 4.典型數(shù)據(jù) 由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標準曲線的OD值會有所差異。以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線。 ? X-濃度（ng/mL） 32 16 8 4 2 1 0.5 0 Y-OD450/650nm 1.816 1.370 0.801 0.403 0.227 0.150 0.114 0.081 Y-OD450/650 nm（去本底） 1.735 1.289 0.720 0.322 0.146 0.069 0.033 0 回收量（ng/mL） 32.02 15.97 8.05 3.92 2.02 1.06 0.54 — 回收率% 100.1 99.8 100.6 98.0 101.0 106.0 108.0 — ? ?? 注意事項 1、?儲存：試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發(fā)和微生物污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。 2、?酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。暫時不用板條應(yīng)拆下后放入備用自封袋，按推薦溫度存放。 3、?加樣：加樣和加同一試劑時，孔與最后孔之間加樣時間間隔過大將導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯的影響到測量值的準確性及重復(fù)性，每次的加樣時間控制在10分鐘之內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 4、?溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜，洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態(tài)。嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 5、?洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要酶標板底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。 6、?試劑配制：試劑盒在運輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用1000轉(zhuǎn)/分離心一分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打4-5次，使溶液混勻。所有試劑請按說明書指示請配制。 7、?顯色時間的控制：加入底物后，請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔五分鐘），如梯度已經(jīng)很明顯，請?zhí)崆凹咏K止液終止反應(yīng)，以避免顏色過深，影響酶標儀讀數(shù)。 8、?底物：請避光保存底物。在儲存和溫育時，避免強光直接照射。 9、?混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器，使用頻率，如無微量振蕩器，可以在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。 10、不同批號的試劑盒組分不能混用（洗滌液和終止液除外）。 11、關(guān)于樣品回收率 1）本試劑盒以測定重組羧肽酶B的抗原性而非活力來推測殘留量，因此試劑盒中標準品采用羧肽酶B的消光系數(shù)（E1%1cm=21.0D, 即當(dāng)A280nm=2.10時，羧肽酶B濃度為1mg/ml）來計算其蛋白含量，以限度保持質(zhì)控的和穩(wěn)定性。 2）不同計量方法以及產(chǎn)品純度的差別可以導(dǎo)致不同來源、不同批次產(chǎn)品中羧肽酶B的蛋白含量不完全一致，也會造成回收率的差異。 3）為避免上述因素影響，建議將用作回收率測試的樣品采用分光光度法（A280nm）估算蛋白含量，再稀釋至適合的濃度用于回收率測試，盡量減少回收率的誤差。 ? 問題分析 若實驗結(jié)果有問題，請及時對顯色結(jié)果拍照，并妥善保存未使用板條及試劑，然后聯(lián)系技術(shù)支持。也可參考以下信息找出原因。 問題描述 可能原因 相應(yīng)對策 ? 標準曲線梯度差 吸液或加液不準 檢查移液器和吸頭 標準品稀釋不正確 溶解標準品時稍微旋轉(zhuǎn)瓶身，輕輕混勻使粉末完全溶解 洗滌不完全 保證洗滌時間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量 顯色很弱或無色 溫育時間太短 保證充足的溫育時間 實驗溫度不正確 使用推薦的實驗溫度 試劑體積不夠或漏加 檢查吸液及加液過程，保證所有試劑按順序足量添加 稀釋不正確 讀數(shù)數(shù)值低 酶標儀設(shè)置不正確 在酶標儀上檢查波長和濾光片裝置 提前打開酶標儀預(yù)熱 變異系數(shù)大 加液不正確 檢查加液情況 ? ? ? 背景值高 ? 檢測抗體的工作濃度過高 使用推薦的稀釋倍數(shù) ? 酶標板洗滌不完全 重新仔細閱讀操作步驟，保證每步清洗完全;如果用自動洗板機，請檢查所有的出口是否有堵塞;是否使用試劑盒配備的洗滌液。 洗液有污染 配制新鮮的洗液 ? 靈敏度低 ELZSA試劑盒保存不當(dāng) 按說明書要求保存相關(guān)試劑 讀數(shù)前未終止 OD讀數(shù)前應(yīng)在每孔中加入終止液