逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝-武漢友名生物

啟動子：RNA聚合酶特異性識別結(jié)合和啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列。有方向性，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游。上游啟動子元件：TATA盒上游的一些特定DNA序列，反式作用因子可與這些元件結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。反應(yīng)元件：與被的信息分子受體結(jié)合，并能調(diào)控基因表達(dá)的特異DNA序列。增強(qiáng)子：與反式作用因子結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，在基因任意位置都有效，無方向性。沉默子：基因表達(dá)負(fù)調(diào)控元件，與反式作用因子結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄活性。Poly(A)加尾信號：結(jié)構(gòu)基因末端保守的AAUAAA順序及下游GT或T富含區(qū)，被多聚腺苷酸化特異因子識別，在mRNA 3′端加約200個A。（2）反式作用因子：能識別和結(jié)合特定的順式作用元件，并影響基因轉(zhuǎn)錄的一類蛋白質(zhì)或RNA。

第yi代腺病毒載體：一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體稱為第yi代腺病毒載體，此類型載體在未經(jīng)過純化時可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的炎1癥反應(yīng)和免1疫反應(yīng)，純化后可以使用，體內(nèi)表達(dá)周期可達(dá)4周。

第二代腺病毒載體：E2A或E4基因缺失的腺病毒載體被稱為第二代腺病毒載體，產(chǎn)生的免1疫反應(yīng)較弱其載體容量和性方面有所改進(jìn)，但病毒包裝難度和出毒和病毒滴度下降厲害，應(yīng)用相當(dāng)局限。

第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的（無病毒載體，gutless vector）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒載體，mini Ad），僅可保留ITR和包裝信號序列。第三代腺病毒載體大可插入35kb的基因，病毒蛋白表達(dá)引起的細(xì)胞免1疫反應(yīng)進(jìn)一步減少，載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因可使得外源基因保持長期表達(dá)，并增加了載體的穩(wěn)定性。這一載體系統(tǒng)需要一個腺病毒突變體作為輔助病毒。

基因?qū)爰?xì)胞常用方法

不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。

由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化，早在1943年，ery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺1炎雙球菌的DNA與無毒肺1炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺1炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿1菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入；用高電壓脈沖短暫作用于也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔（electroporation）轉(zhuǎn)化法