分子生物學(xué)檢測(cè)病毒-英瀚斯(在線咨詢)-南京分子生物

LncRNA芯片

Long non-coding RNAs（lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的功能性非編碼RNA分子。目前的研究已證實(shí)，lncRNA參與X染色體沉默，基因組印記以及染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄ji活，轉(zhuǎn)錄干擾，核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要調(diào)控過(guò)程。隨著對(duì)lncRNA在哺乳動(dòng)物進(jìn)化及人類疾病發(fā)生和發(fā)展中作用的日益關(guān)注，lncRNA調(diào)控機(jī)制已成為當(dāng)前遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

篩選出差異表達(dá)的lncRNA是研究其在人類疾病發(fā)生中所扮演角色的基礎(chǔ)。富衡生物為用戶提供高通量的lncRNA芯片進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析，該芯片基于Agilent的SurePrint技術(shù)生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定可靠。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

信息覆蓋廣泛：覆蓋了多個(gè)quan威lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的數(shù)據(jù)；提供人，小鼠，現(xiàn)代分子生物學(xué)與基因工程，大鼠的lncRNA檢測(cè)。

lncRNA和mRNA同時(shí)檢測(cè)：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列檢測(cè)探針。一次芯片實(shí)驗(yàn)可同時(shí)對(duì)lncRNA和mRNA進(jìn)行分析。

平臺(tái)成熟可靠：采用Agilent原位噴墨合成技術(shù)，了高檢測(cè)靈敏度和特異性。

數(shù)據(jù)分析：提供lncRNA和mRNA表達(dá)譜差異分析和功能分析，以及二者的關(guān)聯(lián)分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

操作步驟

1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddH2O至

μl 50

視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上執(zhí)行擴(kuò)增。-般:在93°C

預(yù)變性3-5min ，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，循環(huán)30-35

次，后在72°C保溫7min。

3.結(jié)束反應(yīng)， PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測(cè)或-20°C長(zhǎng)期保存。

4. PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以

除去石蠟油;否則，南京分子生物，直接取5- 10μl電泳檢測(cè)。

分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光定量PCR檢測(cè)

熒光定量PCR是檢測(cè)生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對(duì)RNA含量進(jìn)行檢測(cè)。Sybr green在低樣本量時(shí)成本較低，分子生物公司，目前選用的較多。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，分子生物學(xué)檢測(cè)病毒，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。

實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測(cè)-RNA逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR檢測(cè)。

結(jié)果示例：

圖 A 基因擴(kuò)增曲線圖；B 基因擴(kuò)增溶解曲線圖；C mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

從圖中可以擴(kuò)增曲線可以看出目的RNA擴(kuò)增效果，溶解曲線可以看出引物識(shí)別特異性情況，通過(guò)使用ΔΔCt方法計(jì)算可以得到每個(gè)組中目的mRNA表達(dá)變化。