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軟gu細胞培養(yǎng)

(1)脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無菌操作下取下雙側股骨頭及膝關節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺，剔除關節(jié)周圍附著的軟組織，打開髖、膝關節(jié)，用尖刀削取關節(jié)軟gu組織，置入裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿，防止軟gu組織被風干。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，將細小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min，細胞實驗 外包 靠譜，收集細胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細胞混懸液。

(5)把消化所得的軟gu細胞混懸液收集于離心管中，經濾網過濾后用細胞計數板計數，并把細胞混懸液密度調整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細胞生長情況并拍照保存。

MTT檢測

MTT 是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數量。

小鼠精原gan細胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個細胞，其中約有 2×104個是精原gan細胞，僅占gao丸生精上皮細胞總數的 0.02～0.03%，精原gan細胞數量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象，細胞實驗外包，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，南京細胞實驗外包，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細胞，再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來，細胞實驗外包公司，并在體外進行培養(yǎng)嘗試. 結果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%，CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%，CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%，二者都陽性細胞占 8.20±3.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1)，CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子，percoll離心后細胞懸液經FACS分選后獲得細胞純度