分子生物檢測技術(shù)-英瀚斯-南京分子生物檢測

Southern雜交

實驗原理

      Southern印跡雜交（Southern blot）是1975年由英國人southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNAl片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNAl片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放l射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

二、大腸菌群檢驗方法:

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的，分子生物檢測公司，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行。 目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同。

(一)國家標(biāo)準(zhǔn):國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即:乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。乳糖發(fā)酵試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36士1C培養(yǎng)48土2h，觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng):將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36士1°C培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。證實試驗:挑取平板上的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36士1°C培養(yǎng)24土2h，觀察產(chǎn)氣情況。

報告:

根據(jù)證實為大腸陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789. 3-94 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗大腸菌群測定》

(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對出口食品中的大腸進(jìn)行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養(yǎng)48士2h，南京分子生物檢測，觀察是否產(chǎn)氣。證實試驗:將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，分子生物檢測技術(shù)，36士1°C培養(yǎng)48士2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》

分子實驗介紹——印跡（Western blot）檢測

通過SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，分子生物檢測，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的起反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二起反應(yīng)（目前主要用HRP標(biāo)記的第二），經(jīng)過底物顯色或自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光，通過儀器或者膠片顯色）。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

實驗流程：細(xì)胞收集-細(xì)胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照

結(jié)果示例：

圖 A不同大小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Western blot檢測圖片；B A蛋白不同培養(yǎng)時間后Western blot檢測圖片；C 使用Image pro plus軟件對A蛋白灰度檢測，A蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計圖