南京circRNA測序檢測實(shí)驗(yàn)-英瀚斯(圖)

1、細(xì)胞準(zhǔn)備：細(xì)胞傳到后，密度達(dá)到70％左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取兩個EP管，一個加入Opti-MEM、核心質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；

3、細(xì)胞孵育：將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；

4、收集病毒：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度檢測:細(xì)胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細(xì)胞比例。

逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建及包裝 ?

? ? ? 逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）是一類RNA病毒。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA再通過DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程形成病毒顆粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種新的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、輔助載體（表達(dá)病毒包裝需要的蛋白質(zhì)）和包裝細(xì)胞系組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在外源基因表達(dá)、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染范圍廣，可以各種細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)入的外源基因可完全融合，對細(xì)胞率高，細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。

? ? ?逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共有兩部分組成：包裝細(xì)胞系和缺陷病毒本身。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，去除了正常的蛋白編碼序列而保留了和包裝信號，通過分子技術(shù)將目的基因插入此載體上，而包裝細(xì)胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？善渌拗骷?xì)胞，此時目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，質(zhì)譜檢測實(shí)驗(yàn)，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會產(chǎn)生新的毒顆粒，保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物性問題。

腺相關(guān)病毒包裝原理

腺相關(guān)病毒( adeno-associated virus， A)是一類細(xì)小病毒， 基銦組為單鏈DNA ，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有g(shù)an染能力。通常需要腺病毒或皰zhen病毒幫助其在體內(nèi)fu制擴(kuò)增。重組腺相關(guān)病毒( recombinant A， rA )是利用A2型基因組與不同xue清型的衣殼蛋白基因組結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體，可將目的基因的CDS區(qū)序列或者RNAi干擾序列插入rA表達(dá)質(zhì)粒中，包裝病毒后gan染細(xì)胞完成對目的基因的操作。腺相關(guān)病毒具有g(shù)an染溫和，免yi原性小，長效穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)，主要應(yīng)用于動物體內(nèi)注射。源井生物提供的腺相關(guān)病毒顆粒經(jīng)過超su離心純化，并通過qPCR對病毒基因拷貝進(jìn)行滴定。腺相關(guān)病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ，可以滿足各類整體實(shí)驗(yàn)的使用要求。