英瀚斯-腺病毒包裝公司
腺病毒包裝廠家
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1、細胞準備：細胞傳到后，密度達到70％左右時進行轉(zhuǎn)染；
2、細胞轉(zhuǎn)染:取兩個EP管，一個加入Opti-MEM、核心質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；
3、細胞孵育：將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；
4、收集病毒：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清；
5、滴度檢測:細胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細胞比例。
聚合酶鏈式反應(PCR)
操作步驟
1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
1QPCR buffer
5 μl
dNTP mix( 2mM )
4 μl
引物1(10pM)
μl 2
引物2 ( 10pM)
2μl
Taq酶(2U/ul)
1 μl
DNA模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddH2O至
μl 50
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上執(zhí)行擴增。-般:在93°C
預變性3-5min ，進入循環(huán)擴增階段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，CRISPR-9病毒包裝公司，循環(huán)30-35
次，后在72°C保溫7min。
3.結(jié)束反應， PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測或-20°C長期保存。
4. PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油，需用100ul進行抽提反應混合液，以
除去石蠟油;否則，直接取5- 10μl電泳檢測。
分子實驗介紹——熒光檢測
細胞熒光染色是以熒光物質(zhì)標記而進行抗原定位的技術。在細胞中，通過特定的標記，可以檢測目的蛋白表達量和表達定位。是細胞中的可直觀觀察細胞內(nèi)蛋白定位和表達的實驗方法。
實驗流程：細胞固定-細胞膜破膜-蛋白封閉-目的蛋白結(jié)合-熒光二抗結(jié)合-DAPI染色-熒光顯微鏡拍照或激光共聚焦顯微鏡拍照。
結(jié)果示例：
細胞熒光染
通過觀察細胞中蛋白的熒光強度和定位分析該蛋白的表達變化。
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