細(xì)胞-南京英瀚斯生物科技-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

成纖維細(xì)胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，細(xì)胞，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，動物細(xì)胞培養(yǎng)，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)將其細(xì)細(xì)切碎。

3. 用200 μ的移液反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，流式細(xì)胞，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。

6. 3x106細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細(xì)胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，按1:5傳代。

9. 細(xì)胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

yao物對細(xì)胞的IC50檢測 ?

? ? ?IC50 (half maximal inhibitory conceation)是指被測量的拮抗劑的半抑制濃度。它能指示某一yao物或者物質(zhì)(yi制劑)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物質(zhì)，比如酶，細(xì)胞受體或是微生物)的半量。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥wu誘導(dǎo)腫liu細(xì)胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時(shí)所對應(yīng)的濃度，IC50值可以用來衡量yao物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低，當(dāng)然也可以反向說明某種細(xì)胞對yao物的耐受程度。

自噬流檢測

自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于自噬流是一個(gè)曲多個(gè)步驟組成的動態(tài)過程。因此往需要精細(xì)的突驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。