細(xì)胞-英瀚斯-流式細(xì)胞

透射電鏡觀察自噬小體方法

利用光學(xué)顯微鏡，借助相應(yīng)的染色方法，可以觀察細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺(tái)盼藍(lán)、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。

電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)報(bào)告，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。

脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

1、細(xì)胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、轉(zhuǎn)染前換上沒有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、將質(zhì)粒DNA (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂質(zhì)體5ul補(bǔ)培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:2或1.5:2.5)。

5、將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含質(zhì)粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。

6、吸取混合物均勻加入每一個(gè)孔中。

7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培養(yǎng)24小時(shí)。

磁性細(xì)胞標(biāo)記方式

應(yīng)用MACS技術(shù)進(jìn)行磁性細(xì)胞分選重要的一點(diǎn)是高質(zhì)量的標(biāo)記。要盡可能地增強(qiáng)陽性細(xì)胞的標(biāo)記，并減弱背景染色。有兩種基本的磁性標(biāo)記方式:直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。

1、直接磁性細(xì)胞標(biāo)記(Direct magnetic cell labeling)

(磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞)直接標(biāo)記是快速、特異的磁性標(biāo)記方法。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類靈長類細(xì)胞的MACS直標(biāo)微珠可供選用。

2、間接磁性細(xì)胞標(biāo)記(Indirect magnetic cell labeling )

(磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞)間接磁性細(xì)胞標(biāo)記需要聯(lián)合使用單ke隆或者多ke隆抗ti和MACS間標(biāo)微珠。未結(jié)合抗ti、生物素化抗ti或者熒光素標(biāo)記抗ti均可作為一抗標(biāo)記細(xì)胞，再使用抗免yi球蛋白微珠、抗生物素或鏈霉親和素微珠、抗熒光素微珠作為二抗磁性標(biāo)記細(xì)胞。幾乎針對(duì)任何種系任何細(xì)胞的任何一種單抗或多抗，流式細(xì)胞，均可用于間接標(biāo)記。間接標(biāo)記主要在如下情況時(shí)選用:當(dāng)沒有直標(biāo)磁珠時(shí);需要用幾種抗ti的混合物同時(shí)分選或去除多種類型的細(xì)胞;間接標(biāo)記有放大作用，因此可在磁性分選抗原表達(dá)弱的目的細(xì)胞時(shí)使用;使用自備或者配體的磁珠分選中。( -般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。)