細胞-英瀚斯-感受態(tài)細胞

小鼠精原gan細胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個細胞，其中約有 2×104個是精原gan細胞，僅占gao丸生精上皮細胞總數(shù)的 0.02～0.03%，精原gan細胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液，流式細胞，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細胞，再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來，并在體外進行培養(yǎng)嘗試. 結果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%，CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%，細胞，CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%，二者都陽性細胞占 8.20±3.98%，感受態(tài)細胞，CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1)，CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子，percoll離心后細胞懸液經FACS分選后獲得細胞純度

細胞傳代培養(yǎng)

操作步驟

1.將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10m培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細zhen孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1- -3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，轉基因技術，分到另外兩到三瓶中，實踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

附:消化液配制方法:

稱取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無Ca2+、Mg2+的Hank's液溶解，濾器過濾chu菌，4°C保存，用前可在379C下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使終濃度達0.02%。

流式細胞分選

流式細胞分選技術是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的--種現(xiàn)代細胞分析技術，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強度和波長將發(fā)光顆粒亞群分開并可實現(xiàn)單ke隆分選，能復雜樣本中的細胞進行鑒定、分類、定量和分離，單次可同時對其中一種到四種特定細胞進行超高速分選純化、高通量單分選或細胞芯片制備。分選后的細胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細胞PCR擴增或原位雜交等，可進一步進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。硬件中樣本細胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標細胞的高回收率。