dna檢測(cè)-pcr-南京英瀚斯

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

操作步驟

1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddH2O至

μl 50

視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上執(zhí)行擴(kuò)增。-般:在93°C

預(yù)變性3-5min ，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，循環(huán)30-35

次，后在72°C保溫7min。

3.結(jié)束反應(yīng)， PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測(cè)或-20°C長(zhǎng)期保存。

4. PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油，pcr，需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以

除去石蠟油;否則，dna檢測(cè)，直接取5- 10μl電泳檢測(cè)。

活性氧檢測(cè)試劑盒（Reactive oxygen species assay kit）是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。 本試劑盒提供了活性氧陽(yáng)性對(duì)照試劑Rosup以便于活性氧的檢測(cè)。Rosup是一種混合物（compound mixture），濃度為50mg/ml。

一、注意事項(xiàng)

1、探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

2、探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。

3、盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

4、為了您的和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

7.如何檢測(cè)引物的純度？

答：實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃，2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，PCR，在主帶之下沒有雜帶，熒光定量pcr，說(shuō)明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

而有的廠家提供Maldi-TOF質(zhì)譜QC質(zhì)量控制，從而保障了合成的準(zhǔn)確率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行全自動(dòng)裝載及監(jiān)測(cè)。 每份樣品的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)將自動(dòng)插入到寡核苷酸的信息單中。Bioneer是上的幾個(gè)對(duì)生產(chǎn)的每份核苷酸 (單個(gè)寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)進(jìn)行核苷酸QC檢測(cè)的廠商，而且免費(fèi)提供質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

8.如何計(jì)算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計(jì)算：V (微升)= OD數(shù)*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報(bào)告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.