細(xì)胞-英瀚斯-293t細(xì)胞

關(guān)于細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng)：

1. ?為保持細(xì)胞大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。

2. ?凍存物距液氮面越近溫度越低。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為－1℃~12℃/ 分鐘，當(dāng)溫度下降達(dá)－25℃時(shí)，細(xì)胞，下降速度可增至－5~－10℃/ 分鐘，到－100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度，過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促冰晶形成。

3. ?初次凍存者在下降凍存時(shí)，宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置，然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法，以觀測(cè)下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，細(xì)胞系，當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。

小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞，其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞，僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%，精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過(guò)慮制成單 細(xì)胞懸液，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞，再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(CD90.2)陽(yáng)性CD117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來(lái)，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占13.80±3.34%，CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占28.98±4.51%， 二者都陽(yáng)性細(xì)胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占12.37±3.34%，CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占56.98±4.51%，二者都陽(yáng)性細(xì)胞占 8.20±3.98%，CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞和二者都陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無(wú)顯著性(P>0.1)，CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞和CD117陰性和CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子，percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度

骨sui內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)

方法:使用密度梯度離

心法汲差速貼壁法聯(lián)合的方法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化，使用Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素1雙熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD133 表達(dá)情況.結(jié)果與結(jié)論:培養(yǎng)前4 d細(xì)胞增殖不明顯第5~10天迅速增殖，293t細(xì)胞，并可見(jiàn)細(xì)胞集落及線狀結(jié)構(gòu)形成培養(yǎng)第7天的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有吞噬Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1的功能流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)第十天的細(xì)胞，CD133+細(xì)胞占19.2%，CD34+細(xì)胞占28.7%，CD34+ /CD133+細(xì)胞占19.1%.說(shuō)明密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法可在體外有效分離培養(yǎng)大鼠骨sui內(nèi)皮祖細(xì)胞.