原代細(xì)胞-英瀚斯(在線咨詢)-自貢細(xì)胞

脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染

1、細(xì)胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、轉(zhuǎn)染前換上沒有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、將質(zhì)粒DNA (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂質(zhì)體5ul補(bǔ)培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:2或1.5:2.5)。

5、將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含質(zhì)粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。

6、吸取混合物均勻加入每一個孔中。

7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培養(yǎng)24小時。

骨sui內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)

方法:使用密度梯度離

心法汲差速貼壁法聯(lián)合的方法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，自貢細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化，使用Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素1雙熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD133 表達(dá)情況.結(jié)果與結(jié)論:培養(yǎng)前4 d細(xì)胞增殖不明顯第5~10天迅速增殖，原代細(xì)胞，并可見細(xì)胞集落及線狀結(jié)構(gòu)形成培養(yǎng)第7天的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有吞噬Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1的功能流式細(xì)胞儀檢測體外培養(yǎng)第十天的細(xì)胞，CD133+細(xì)胞占19.2%，CD34+細(xì)胞占28.7%，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，CD34+ /CD133+細(xì)胞占19.1%.說明密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法可在體外有效分離培養(yǎng)大鼠骨sui內(nèi)皮祖細(xì)胞.

1、操作步驟 [方法一]：

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：取 6 孔培養(yǎng)板 (或用 35 mm 培養(yǎng)皿)，向每孔中加入 2 mL 含 1～2×105 個細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃ CO2 培養(yǎng)至 40%～60% 匯合時 (匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。

(2) 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液 (為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)A 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 1-10 μg DNA，終量 100μL，B 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 2-50 μgLR，終量 100μL，輕輕混合 A、B 液，室溫中置 10-15 分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染 (如出現(xiàn)沉淀可能因 LR 或 DNA 濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。

(3) 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用 2 mL 不含培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入 1 mL 不含培養(yǎng)液。

(4) 轉(zhuǎn)染：把 A/B 復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃ 溫箱置 6～24 小時，單細(xì)胞測序，吸除無轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時切勿加，對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。