南京英瀚斯生物科技(圖)-細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)-海南細(xì)胞

大鼠shen小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.原代細(xì)胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:SD大鼠用25%烏拉坦腹整注射麻后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動(dòng)脈，以無菌的冷Hank液漱朱洗血.同時(shí)剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白，取出雙shen冰浴保存。

(2)shen小球分離:參照Green等方法改進(jìn)。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm'的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過80.120和200目鋼篩。收集shen小球。

(3)shen小球消化和培養(yǎng)；將提取的shen小球加人0.1% IN 型膠原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶內(nèi)，加A配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰島素/ml.血管內(nèi)皮生長因子20 ng /ml、肝素鈉100 u/ml.青莓su100 U/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進(jìn)行純化。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

污染

污染后，癌細(xì)胞，培養(yǎng)基一般清澈，保持原色。細(xì)絲可以在顯微鏡下觀察到。，一些類似于死細(xì)胞碎片，但其中許多清晰可見，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，看起來像珊瑚，比較容易區(qū)分。此外，它們會(huì)慢慢長出細(xì)細(xì)的黑色細(xì)絲，因?yàn)樗鼈兩L得比較慢，不像那樣容易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基被污染，它們將很難存活。

解決方法：一旦被污染，果斷丟棄，然后對細(xì)胞房、CO2 培養(yǎng)箱、器皿和培養(yǎng)基進(jìn)行消毒。

小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞，其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞，僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%，精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，海南細(xì)胞，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞，再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細(xì)胞占13.80±3.34%，CD90.2陽性細(xì)胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細(xì)胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細(xì)胞占12.37±3.34%，CD90.2陽性細(xì)胞占56.98±4.51%，二者都陽性細(xì)胞占 8.20±3.98%，CD117陰性CD90.2陽性細(xì)胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細(xì)胞和二者都陽性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1)，CD90.2陽性細(xì)胞和CD117陰性和CD90.2陽性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子，percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度