細(xì)胞增殖-細(xì)胞-南京英瀚斯生物科技(查看)

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細(xì)胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養(yǎng)皿) 培養(yǎng) 24 小時(shí)，細(xì)胞，使其達(dá)到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在 1 mL 無(wú) DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質(zhì)粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉(zhuǎn) 1 秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3) 棄去細(xì)胞中的舊液，用 1 mL 無(wú) DMEM 洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃ 培養(yǎng) 3～5 小時(shí)。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 14～24 小時(shí)，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培養(yǎng) 24～48 小時(shí)。

(6) 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1) 接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至 50% 板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果分析，37℃ 培養(yǎng) 48 小時(shí)。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。

大鼠脂肪的分離

?將手術(shù)切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

?經(jīng)手術(shù)切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養(yǎng)24 h，且肉眼觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶底部貼附著一層網(wǎng)狀薄膜，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可使這層網(wǎng)狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都附著于這層膜上，通過(guò)術(shù)獲取的人脂肪組織消化后則無(wú)此現(xiàn)象。增加膠原酶的量和消化時(shí)間也無(wú)法避免，取材時(shí)的或脂肪間結(jié)締組織未被完全消化，穿過(guò)細(xì)胞篩進(jìn)入了培養(yǎng)瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，但不會(huì)損傷其他蛋白質(zhì)。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細(xì)胞篩過(guò)濾后傳代。 根據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，每毫升手術(shù)切除的大鼠脂肪可分離基質(zhì)血管成分細(xì)胞約1.81×106個(gè)。原代培養(yǎng)2.24×10^7個(gè)大鼠基質(zhì)血管成分細(xì)胞，40 h后傳代時(shí)約剩余 6.2×10^6個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞剩余率27%。

選擇實(shí)驗(yàn)外包公司需要注意哪些事項(xiàng)？

技術(shù)支持

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