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細胞實驗介紹——流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

流式細胞術(shù)檢測細胞周期：

細胞周期：指細胞從次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當DNA成為4倍體時，細胞進入G2期。G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，廣東細胞，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。

細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。

一般流程：細胞收集-PI-AnnexinV標記-流式細胞儀檢測。

結(jié)果示例：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖 A 細胞周期檢測圖；B 細胞凋亡檢測圖

血管生成技術(shù)

一、服務(wù)介紹

zhong瘤血管生成是一個極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞移行、內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。由于zhong瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進入血流并在遠隔部位形成轉(zhuǎn)移。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細血管性血管的生長。無論原發(fā)性zhong瘤還是繼發(fā)性zhong瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于zhongt瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。

成纖維細胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，細胞培養(yǎng)技術(shù)，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)將其細細切碎。

3. 用200 μ的移液反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，細胞分化，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。